柑橘是世界第一大水果，我国是柑橘初生起源中心，资源丰富。多胚性状（即一个种子内含多个珠心胚）是柑橘特有的孢子体无融合生殖方式。无融合生殖可以产生与母体遗传组成相同的克隆后代，长期用于繁育整齐一致的砧木和固定优异品种的种性。但珠心胚干扰合子胚发育，导致有性杂交难以获得杂种，是柑橘杂交育种的“卡脖子”难题。
近日，New Phytologist期刊在线发表了51吃瓜网 果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室/湖北洪山实验室郭文武教授/伍小萌教授团队题为“The lineage-specific CitmiRn23-CitXS20 module regulates apomixis in citrus through modulation of H2O2 level”的研究论文。该研究揭示了柑橘特异CitmiRn23-CitXS20模块通过调节胚珠H₂O₂水平，进而调控柑橘珠心胚发生的分子机理；基于该理论基础，通过CitmiRn23过量表达或外源活性氧清除剂处理，有效降低了柑橘种子多胚水平，为降低珠心胚干扰和提高柑橘杂交育种效率提供了新的理论依据和可行的调控途径。
该研究鉴定到CitmiRn23是柑橘特异的新miRNA，能剪切编码含XS结构域蛋白的靶基因CitXS20并抑制其表达。CitmiRn23前体pre-miRn23与靶基因CitXS20在多胚型和单胚型柑橘胚珠中表达呈相反模式，即pre-miRn23在多胚型胚珠表达水平低于单胚型胚珠，而CitXS20在多胚型胚珠表达水平高于单胚型胚珠。pre-miRn23存在于柑橘亚科多数类群，且pre-miRn23和CitXS20序列在柑橘亚科内高度保守；CitXS20及其同源基因在植物中广泛存在，但非柑橘亚科物种CitXS20均缺失CitmiRn23识别元件（图1）。
图1 miRn23前体和靶基因CitXS20表达模式及其序列特异性和保守性
在短童期的多胚型山金柑过表达CitmiRn23（miROE）或干涉CitXS20（XSR），均能抑制珠心胚发生，降低单粒种子胚数，同时提高单胚种子率和杂种率（图2）。为解析CitmiRn23-CitXS20模块调控柑橘珠心胚发生的机理，通过酵母双杂筛选出CitXS20互作蛋白，生化实验表明CitXS20与柑橘过氧化氢酶CitCAT2互作，该互作抑制了CitCAT2过氧化氢酶活性，从而提高了胚珠H₂O₂水平。染色实验显示在柑橘珠心胚起始发生（NEI）关键时期，多胚型胚珠H2O2水平高于单胚型胚珠，且H2O2特异积累在多胚型胚珠的胚囊周围珠心组织（珠心胚起始细胞聚集区）。田间试验证实，外源H₂O₂喷施或灌根处理可提高山金柑、四季橘种子多胚水平，而NADPH氧化酶抑制剂DPI处理降低了柑橘胚珠H₂O₂水平，同时也降低了种子多胚水平，提高了以多胚型柑橘为母本的杂种率。
图2 过表达pre-miRn23抑制山金柑珠心胚发生进而提高杂种率
基于以上结果提出了CitmiRn23-CitXS20模块调控柑橘珠心胚发生工作模型：多胚型胚珠中CitmiRn23低表达，解除了对靶基因CitXS20表达的抑制；CitXS20与过氧化氢酶CitCAT2互作抑制H2O2清除，导致胚珠H2O2水平升高，进而促进珠心胚发生；而在CitmiRn23过表达株系中，CitmiRn23抑制靶基因CitXS20表达，互作蛋白CitCAT2酶活释放并清除胚珠H2O2，导致胚珠H2O2水平下降，进而抑制珠心胚发生，同时提高了多胚种子的合子胚存活率（图3）。该研究揭示了柑橘特异CitmiRn23-CitXS20模块调节胚珠H2O2水平，进而调控珠心胚发生的机理。根据该工作模型，开发了降低柑橘多胚水平进而提高杂交育种效率的方法（专利号 ZL202310899599.6），无需幼胚挽救技术，已高效创制多胚品种为母本的有性后代数百株，拓宽了柑橘新品种培育的材料基础。
图3 柑橘CitmiRn23-CitXS20模块通过调节H2O2水平调控珠心胚发生模型
51吃瓜网 果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室博士研究生卿美为该论文第一作者，伍小萌教授为通讯作者。郭文武教授和邓秀新院士为该项究提供了重要指导，解凯东副教授、贾慧慧博士、谈晓燕硕士、杨佳铭硕士、博士生包逸以及中国农业科学院农业基因组研究所博士后王楠等参与了研究工作。该研究受到国家自然科学基金青年基金B类、教育部学科突破计划等项目资助。
原文链接：//doi.org/10.1111/nph.71220
文图：卿 美
审核：伍小萌 郭文武
