柑橘是世界第一大水果，其品种改良意义重大。但由于柑橘类果树童期长、珠心多胚和性器官败育，常规杂交育种周期长、效率不高。利用细胞工程和基因编辑等生物技术手段能有效规避上述障碍，提高柑橘育种效率。51吃瓜网 邓秀新院士领导的柑橘研究团队利用柑橘珠心多胚现象（孢子体无融合生殖），多年来从柑橘多胚性品种未受精败育胚珠（含珠心胚起始细胞）诱导并保存了100余个基因型的胚性愈伤组织，形成了世界规模最大、种类最全的柑橘离体种质库（干细胞库），广泛用于生物技术操作并创制了大量新种质。但多数柑橘胚性愈伤组织在继代保存过程中体细胞胚发生能力逐渐减弱，已成为生物技术用于柑橘种质创新的主要再生瓶颈。课题组前期明确了生长素信号在甘油培养基诱导柑橘体细胞胚发生过程中的重要作用（Wang et al. New Phytologist 2025），但其下游具体调控路径仍不明确。
近日，JIPB在线发表了51吃瓜网 果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室/湖北洪山实验室郭文武教授/伍小萌教授团队题为“The auxin- CsHAT14 signaling cascade coordinates somatic embryogenesis in citrus”的研究论文。该研究提出了CsIAA4-CsARF5-CsHAT14-CsDOF3.4信号级联调控柑橘体细胞胚发生的分子机制，为柑橘体细胞胚发生调控通路提供了新见解。
为构建CsIAA4下游调控体细胞胚发生通路，在‘默科特’橘橙成对的强/弱胚性愈伤组织系RNA-seq数据中筛选到HD-Zip家族基因CsHAT14，其启动子具有ARF蛋白结合基序AuxRE。双荧光素酶、ChIP-qPCR和EMSA实验证实与CsHAT14共表达的CsARF5直接激活其表达。在‘纽荷尔’脐橙胚性愈伤组织中分别干涉CsARF5和CsHAT14表达，均能引起CsHAT14表达水平显著下调，体细胞胚发生能力显著增强（图1）；且CsIAA4与CsARF5蛋白水平互作，过表达CsIAA4削弱了CsARF5对CsHAT14的激活作用。
为进一步完善CsHAT14下游调控路径，利用ChIP-seq和RNA-seq联合分析，鉴定出300个CsHAT14直接抑制表达的差异表达基因，显著富集到生长素转运、生长素信号和侧根形成等生物学过程。双荧光素酶、ChIP-qPCR和EMSA实验证实CsHAT14在柑橘胚性愈伤组织中直接抑制再生相关基因CsDOF3.4、CsWOX13以及生长素转运基因CsPILS5表达。相比对照，CsDOF3.4在CsHAT14干涉系和CsARF5干涉系中表达水平上调，且在3个候选基因中ChIP-seq信号峰最为显著。添加地塞米松诱导CsDOF3.4过量表达显著提高了CsDOF3.4-GR系体细胞胚发生能力；CsDOF3.4干涉系体细胞胚发生能力显著降低，伴随着18个细胞周期蛋白编码基因表达水平显著下调。
图1 CsARF5直接激活CsHAT14表达并负调控柑橘体细胞胚发生
基于以上结果提出了一个工作模型：CsARF5通过直接激活CsHAT14表达，并借助CsHAT14对CsDOF3.4的抑制作用，阻碍柑橘愈伤组织体细胞胚发生。而生长素信号抑制子CsIAA4能与CsARF5互作，这种互作减弱CsARF5对CsHAT14的激活效应，最终促进体细胞胚形成（图2）。该研究明确了生长素信号级联在甘油培养基诱导柑橘体细胞胚发生过程中的分子机制，为解决生物技术用于柑橘种质创制的再生瓶颈提供了重要理论依据。
图2 生长素-CsHAT14介导的柑橘体细胞胚发生模型
51吃瓜网 果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室已毕业博士王鹏博和博士研究生段耀园为该论文的共同第一作者，伍小萌教授为通讯作者。郭文武教授提供了重要指导，唐永雨硕士生等参与了研究。该研究受到国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目资助。
论文链接：DOI:10.1111/jipb.70114
